本文是学习GB-T 34736-2017 绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测技术. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测的试剂、材料和设备、抽样、操作方法、结果判定等。
本标准适用于检测临床疑似病羊和进出口种羊肺组织或外周血液样品中绵羊肺腺瘤病毒核酸，也
适用于羊临床样品中绵羊肺腺瘤病病原的快速检测。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1
斑点杂交 dot blotting hybridization
利用核酸探针，在杂交膜上与待测样本核酸 DNA
杂交，核酸探针带有供反应后检测的合适标记
物，并与特异靶分子结合形成杂交体，再用呈色反应显示。斑点杂交是直接将待检羊只的组织或血液样
品 DNA
变性后，点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再与制备的特异性探针进行杂交来检测样品中的前
病毒 DNA 的分子杂交技术。
下列缩略语适用于本文件。
AMV: 鸟类 RNA 病毒反转录酶(Avian Myeloblastosis Virus)
BCIP:5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate)
cDNA: 互补 DNA(Complementary DNA)
DNA: 脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)
dNTPs:4 种脱氧核糖核苷三磷酸混合物(Deoxyribonucleoside Triphosphates)
EDTA: 乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid)
enJSRV: 内源性绵羊肺腺瘤病毒(Endogenous Jaagsiekte Sheep Retrovirus)
ERV: 内源性逆转录病毒(Endogenous Retrovirus)
JSRV: 绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte Sheep Retrovirus)
NBT: 四唑氮蓝(Nitro-Blue-Tetrazolium)
OPA: 绵羊肺腺瘤病(Ovine Pulmonary Adenomatosis)
PCR: 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
GB/T 34736—2017
RNA: 核糖核酸(Ribonucleic Acid)
RT:反转录(Reverse Transcriptase)
SDS: 十二烷基磺酸钠(Sodium Dodecyl Sulfonate)
SSC: 柠檬酸钠盐(Saline Sodium Citrate)
Tris:三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)
除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯。提取病毒 RNA
所用试剂应使用无RNA 酶的容
器进行分装。
GB/T 6682,三级水。
4.2 商品化的 DNA 提取试剂盒
用于组织和血液样品 DNA 的提取，4℃~8℃保存。
4.3 商品化的 RNA 提取试剂盒
用于组织和细胞总 RNA 的提取，4℃~8℃保存。
4.4.1 1 mol/L 马来酸：配制见A.1。
4.4.2 洗涤缓冲液(马来酸缓冲液):配制见 A.2。
4.4.3 检测缓冲液：配制见 A.3。
4.4.4 1 mol/L Tris-盐酸溶液：配制见 A.4。
4.4.5 10% SDS溶液：配制见 A.5。
4.4.6 20倍稀释 SSC 缓冲溶液：配制见 A.6。
4.4.7 封闭溶液：配制见 A.7。
4.4.8 抗体溶液：配制见 A.8。
4.4.9 预杂交溶液：配制见 A.9。
4.4.10 杂交溶液：配制见 A.10。
4.4.11 NBT/BCIP 显色液：配制见 A.11。
4.4.12 0.2 mol/L EDTA:配制见 A.12。
用于特异性探针的标记和灵敏度检测，保存于-20℃。
制备探针所需模板 RNA 见 B.1。
4.7 制备探针所需特异性引物和探针序列
制备探针所需特异性引物和探针序列参见附录 C 和附录 D。
GB/T 34736—2017
4.8 AMV 逆转录酶及5倍逆转录酶反应缓冲液
AMV 逆转录酶及5倍逆转录酶反应缓冲液，保存于-20℃,避免反复冻融。
4.9 Taq 酶及10倍 Taq 酶反应缓冲液
Taq 酶及10倍 Taq 酶反应缓冲液，保存于-20 ℃,避免反复冻融。
5.2
微量加样器：量程分别0.2μL～2μL、1μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL和100μL~
1000μL 的移液器，并配备与移液器相匹配的吸头。
5.3 高速冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000 r/min 以上。
5.10 高温鼓风干燥箱(可调温度至120℃)。
用无菌剪刀和镊子剪取肺脏组织，如果肺叶上有明显的灰白色结节的典型病变时，采集病变与正常
交界处的组织。将待检样品装入冻存管，编号，迅速放入液氮罐中备用。
颈静脉采血，用淋巴细胞分离液收集白细胞。编号，迅速放入液氮罐中备用。
样本采集后迅速放入液氮罐中，若需长期保存应放在一80℃冰箱，应避免反复冻融。
取约黄豆粒大小的组织样品或血液白细胞分离液(1 mL,
细胞密度2×10⁵个/mL～10×105 个/mL), 采用常规 DNA
提取试剂盒，按说明书的方法进行操作，提取得到的 DNA
样品用1%琼脂糖凝胶电泳
检测，保证样品 DNA 的完整和估测 DNA 浓度达500 ng/μL,并于4 ℃保存备用。
探针标记的具体步骤和灵敏度检测方法的详细说明见附录B。
GB/T 34736—2017
剪取适合大小的尼龙膜(斜剪口，由小到大),放在15 mL 双蒸水中漂洗10
min,让尼龙膜完全湿
润，取出后再浸泡在20 mL20 倍 SSC 溶液中10
min,然后放在3层灭菌滤纸上，于室温干燥3 min。
将待测 DNA 10μL(100 ng/μL)样品煮沸14 min,快速放入冰水浴中，骤冷10
min。
将7.1中制备的 DNA 样品取1 μL 点在杂交膜上于120℃烘箱中烘30 min。
将杂交膜封入杂交袋中。加入预杂交溶液，每组500μL
全部加完，使膜漂起即可，除去气泡，置
37℃~42℃的恒温摇床上，轻轻振摇1 h。
剪开杂交袋一个小角，倾去预杂交液，加入含3 μL 的 env 探针或U₃ 探针(20
pmol/μL)的杂交液
500μL,除去气泡，封口。40℃过夜，大约12 h～16 h。
将杂交膜放入小烧杯(或抗体孵育盒)中，加20 mL 洗涤溶液，在摇床中(40℃、70
r/min)洗膜
2次，每次30 min。
取出杂交膜，在20 mL 预热(40℃)10 min 的马来酸冲洗缓冲液的平皿中浸泡3
min 平衡后，转入
20mL10% 封闭溶液中，室温作用60 min。
将杂交膜取出，放入一个新的平皿中，加入20 mL
含抗地高辛抗体的封闭溶液中，室温作用
将杂交膜取出，放入含有20 mL 马来酸冲洗缓冲液的平皿中，在摇床中(40℃、70
r/min)洗膜
2次，每次15 min;将膜取出，放入含有20 mL 检测缓冲液的平皿中平衡5 min。
7.3.10 显色
将杂交膜放入20 mL 新制备的显色液中静置避光(铝纸包裹)显色6 h～12
h。用无 RNA 酶水终
止反应5 min。 杂交膜自然干燥后观察照相，避光保存。
GB/T 34736—2017
采用已构建好的绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因的阳性质粒为阳性对照，设无探针杂交序列的内源性绵
羊肺腺瘤病毒囊膜基因质粒为阴性对照。
阳性对照出现斑点和阴性对照同时不出现斑点为检测结果判定成立的前提条件，否则结果不成立。
膜上样品的点样处同时不出现斑点视为阴性。
点样膜上两个env 探针和U₃ 探针(参见附录 C)
同时出现清晰的斑点为阳性结果。其中一个探针
点样处出现斑点为疑似病例，需再次判定。
GB/T 34736—2017
(规范性附录)
杂交所需溶液配制
A.1 1 mol/L 马来酸
116.08g 马来酸溶于800 mL 无 RNA 酶水中，定容至1000 mL, 高压灭菌备用。
A.2 洗涤缓冲液(马来酸缓冲液)
1 mol/L马来酸50 mL,5 mol/L氯化钠溶液15 mL, 添加无 RNA 酶水至400 mL,
用氢氧化钠调
pH 至7.5,再加1.5 mL 吐温-20,最后再加无 RNA 酶水定容到500 mL,
高压灭菌，室温保存。
A.3 检测缓冲液
1 mol/LTris-盐酸(pH 9.5)10 mL,5 mol/L氯化钠2mL, 加80 mL 无 RNA
酶水，0.1 mol 盐酸调
pH 至9.5,定容至100 mL, 高压灭菌。
A.4 1 mol/L Tris-盐酸溶液
121.14g Tris碱，溶于800 mL 无 RNA 酶水中，调 pH 至9.5,定容至1000 mL,
高压灭菌，4℃
储存。
A.5 10% SDS 溶液
10g 十二烷基磺酸钠(SDS), 溶于80 mL 的无RNA 酶水中，加热约68℃溶解，调pH
至7.2,定容
至100 mL,4℃ 存放，4℃储存。
A.6 20 倍 SSC 溶 液
87.65g 氯化钠，44.1 g 柠檬酸钠，溶于400 mL 的无 RNA 酶水中，调 pH
至7.0,定容至500 mL,
4℃储存。
A.7 封闭溶液
马来酸缓冲液将10倍封闭液(试剂盒中提供)稀释成1倍封闭液(现用现配)。
A.8 抗体溶液
使用前将抗地高辛碱性磷酸酶溶液按10000 r/min 离 心 3 min,
从表面吸取一定量并用封闭溶液
1:5000 稀释。
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A.9 预杂交溶液
25%去离子甲酰胺 25 mL
20XSSC 液 20 mL
10%封闭液 20 mL
10% SDS液 20 mL
0.5 mol/L 磷酸氢二钠(Na₂HPO₄) 10 mL
0.1 mol/L N-乙酰十二烷基肌氨酸钠 5 ml
试剂盒中提供的地高辛标记的杂交小颗粒(DIG Easy Hyb
Granyles)直接溶解即可使用。
A.10 杂交溶液
取 3 μL 的 env 探针或U3 探针(20 pmol/μL)放入PCR 管中，沸水浴10 min,
快速放入冰水中骤冷
10 min,加 入 1 mL 预杂交液中，混合均匀备用。
A.11 NBT/BCIP 显色液
吸取试剂盒中40 μL 四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(NBT/BCIP)
混合溶液加到2 mL 的显色
缓冲液中，此液现用现配。
A.12 0.2 mol/L EDTA 溶液
EDTA1.1690g, 溶于20 mL 无 RNA 酶水中，用氢氧化钠调pH
至8.0,高压灭菌，4℃避光保存。
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(规范性附录)
特异性探针的制备与检测步骤
B.1 制备探针所需模板 RNA
取约黄豆粒大小的自然感染绵羊肺腺瘤病的肺组织样品，采用市售商品化 RNA
提取试剂盒，按说 明书的方法进行操作，RNA
提取操作应在通风柜或生物安全柜中进行，避免RNA 气溶胶的污染，估测
总 RNA 浓度达500 ng/μL,并于4℃保存备用。
B.2 反转录(RT) 反应体系
采用10μL 体系，在PCR 管中依次加入模板 RNA(500 随机引物(50
pmol/μL)0.5μL,5 倍反应缓冲液2μL,AMV
10μL。 反转录条件为：37℃ 15 min,85℃ 5s。
ng/μL)1μL,dNTPs(25 pmol/μL)0.5μL,
反转录酶0.5μL,其余用无RNA 酶水补至
B.3 PCR 反应体系
反应总体系为50μL, 在 PCR 管中依次加入 Taq 酶(5 U/μL)0.5μL,10 倍 反 应
缓 冲 液 5 μL,
dNTPs(215 mmol/L)4μL,反转录的cDNA 模板(步骤 B.2 得到)2μL(500 ng/μL),20
pmol/μL 的上、
下游引物 env-P1,env-P2;U3-P1,U³-P2 (引物序列参见附录 C) 各 1 μL,
其余用无 RNA 酶水补至
B.4 PCR 循环条件
94℃预变性2 min,94℃ 变性30 s,env 基 因 5 2 ℃ 退 火 3 0 s,U₃ 区52℃退火30
s,72℃ 延 伸 1min, 分别进行35个循环，最后于72℃延伸10 min。 反应后，PCR
产物取5μL, 在1%琼脂糖凝胶电
泳检测。
B.5 cDNA 探针的制备步骤
B.5.1 按程序B.3 扩增的绵羊肺腺瘤病毒enʊ 基因和U₃
区产物经纯化后，分别取1μg 放入1.5 mL 离
心管中作为模板，并加灭菌双蒸水到16μL。
B.5.2 将1.5 mL 离心管放在沸水浴变性10 min,
迅速将其转移到冰浴中冷却。
B.5.3 在变性DNA 中加入4μL 的地高辛标记混合物，混匀并且瞬时离心。
B.5.4 37℃ 孵育20 h, 预计地高辛标记产物量约为1050 ng。
B.5.5 加入 EDTA 2μL(0.2 mol/L,pH 8.0),且65℃水浴10 min,
以终止标记反应， - 20℃保存
备用。
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B.6 cDNA 探针的检测
B.6.1 将地高辛标记产物和对照样品DNA 用稀释液(试剂盒中提供)稀释成10
pg/μL,3 pg/μL,1 pg/μL,
0.3 pg/μL,0. 1 pg/μL。
B.6.2 取不同浓度的地高辛标记产物和对照 DNA 各 1 μL
平行点至尼龙膜上，120℃烘焙30 min, 使
核酸与膜结合。
B.6.3 将膜放入塑料平皿，加20 mL 马来酸缓冲液，10℃~25℃下摇床反应2
min, 用10 mL 封闭液 孵育30 min,再用10 mL 抗体溶液孵育30 min,再用10 mL
洗涤缓冲液洗涤2次，每次15 min, 然后用
B.6.4 将膜转到另一平皿中，加入2 mL 现配 NBT/BCIP
显色液于黑暗中显色16 h, 用50 mL 灭菌双
蒸水5 min 终止反应，根据尼龙膜上出现的斑点与对照样品 DNA
对比，确定探针的灵敏度。
B.7 探针浓度规定
eno 探针浓度是0.27ng/μL,大于或等于0.27ng/μL的探针均可使用。 U₃
探针浓度是0.18ng/μL,大
于或等于0.18 ng/μL 的探针均可使用。
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(资料性附录)
制备探针所需引物序列
制备探针进行 PCR 反应所需引物序列见表C.1 和表 C.2。
表 C.1 制备 env 探针所需引物序列
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|---|---|---|
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20 pmol/μL |
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|
20 pmol/μL |
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表 C.2 制备 U₃ 探针所需引物序列
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|---|---|---|
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20 pmol/μL |
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20 pmol/μL |
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(资料性附录)
探针的核酸序列
D.1 env探针序列
gagtagccaaaggagaacaggttataatagtaaaacagcctgcctttgtaatgctgcccgttgaaatagctgaagcctggtatgatgaaactg
ctttagaattattacaacgcattaatacggctctcagccgccctaagagaggcctgagcctgattattttgggtatagtatctttaatcaccctcat
agctacagctgttacggcttccgtatctttagcacagtctattcaagctgcgcacacggtagactccttatcatataatgttactaaagtgatggg
gacccaagaagatattgataaaaaaatagaagataggctatcagctctatatgatgtagtcagagtcttaggagagcaagttcagagcattaat
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actaaatatagccgatactgttgataatttcttgcaaaatttattctctaattttcctagtctccattcgctgtggaaaaccctgattggtgtaggaat
acttgtgtttattataattgtcgtaatccttatatttecttgccttgTtcgtggcat
D.2 U₃ 探针序列
tttecttgccttgttcgtggcatggttcgcgattttctaaagatgagagttgaaatgctgcatatgaaatatagaaatatgttacagcaccaacatc
ttatggagcttttaaaaaataaagagaggggagatgcgggggacgacccgtgaagggttaagtcctgggagctctttggcagaagccaaagc
ctaggacaagtacctaagcteectgtcccgccaccctcaagaatttttaaaagctcttaaggctcggatgtttgcttttggcactgcttcatagaaa
taccaggaaatctgattatataagaatccggtgaTtgtgtaagaatccggtgggtgtagtgaataatg
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DB32-T 4451.3-2023 医用影像设备临床使用管理与质量控制规范 第3部分：医用血管造影X射线机（DSA） 江苏省.pdf